等度分離是指在洗脫過程中流動相組成不變的分離方法；而梯度分離是指在洗脫過程中流動相的組成隨運(yùn)行過程而變化的分離方法。梯度分離可以通過逐漸增加強(qiáng)溶劑的濃度，從而兼顧樣品的分離度及保留時間。
6. 梯度洗脫中的基線問題更為普遍，并且必須使用高純?nèi)軇?/div>
梯度洗脫的應(yīng)用范圍
1. 樣品組分復(fù)雜，K值分布寬
2. 大分子樣品，尤其是生物樣品，如多肽的分離
3. 樣品中含有晚流出干擾物，它們會污染色譜柱或在后續(xù)的運(yùn)行中流出
分離度的優(yōu)化
梯度洗脫方法的影響因素比較多，所以當(dāng)采用一種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行梯度試驗的時候，會因為使用的系統(tǒng)的不同或色譜柱的不同，而使得目標(biāo)峰的保留時間和分離效果有很大的差異
藥典方法，作為一種法定的方法，流動相的組成不能隨意變動。此時，實驗者可以調(diào)整的只有色譜柱的品牌和梯度比例或速率。一部分實驗者并不十分重視的色譜柱選擇，對于梯度方法是更為重要的。即使同樣的鍵合相，但生產(chǎn)廠家的不同或品牌的不同，其孔徑、比表面積等填料參數(shù)均有很大差異，對樣品的選擇性也會有很大的差異。從經(jīng)驗來說，選擇一只合適的色譜柱會更節(jié)約實驗中的人力和物力的消耗。您可以根據(jù)分離需要，咨詢色譜柱廠家，以獲得更專業(yè)的色譜柱推薦。確定色譜柱之后，如果需要對分離度進(jìn)行調(diào)整，首先應(yīng)該從保留時間較短的一對色譜峰的分離度開始調(diào)整，然后一對一對依次進(jìn)行調(diào)整。梯度方法和等度方法改善樣品分離度的方法和思路是一致的。
注意事項
1． 基線漂移
當(dāng)采用梯度洗脫時，流動相的純度不夠易導(dǎo)致基線明顯漂移。
2. 干擾峰
當(dāng)進(jìn)行空白梯度試驗時，尤其用短波長UV檢測和高靈敏度設(shè)置時，色譜圖中可能會出現(xiàn)很大的譜峰。這類干擾峰可能由流動相中含有的疏水性的并具有UV吸收的雜質(zhì)引起，如水、有機(jī)溶劑或流動相添加劑。出現(xiàn)這樣的狀況可通過簡單的實驗查出污染源。
查找污染源的*步是先用水相平衡柱30min，然后進(jìn)行一次空白梯度。然后平衡5min后重復(fù)空白梯度。如*次運(yùn)行的干擾峰大得多，可能是水污染。如兩次空白運(yùn)行無差異，有機(jī)溶劑的問題可能較大。流動相添加劑的可能污染可通過重復(fù)不哈添加劑的空白梯度來檢測。當(dāng)鑒別出流動相溶劑或組分被污染后，必須用干凈的試劑代替原試劑。
另外，如果梯度條件設(shè)置錯誤也容易導(dǎo)致干擾峰的出現(xiàn)。如線性梯度被設(shè)置為臺階梯度
4. 色譜峰保留不重復(fù)
由于實際樣品可能含有的強(qiáng)保留的雜質(zhì)。如果梯度的zui終流動相組成僅為洗脫目標(biāo)組分，則強(qiáng)保留的雜質(zhì)可能會在色譜柱上發(fā)生聚集，因而會改變柱效和保留值。所以建議在梯度洗脫末尾時，保持強(qiáng)洗脫溶劑一段時間，以便清洗色譜柱，保證更好的重復(fù)性。
梯度洗脫中，在一次進(jìn)樣結(jié)束后，應(yīng)該用初始流動相平衡色譜柱一段時間后，再進(jìn)行下一次實驗。如果不能*平衡柱子，色譜圖中的早期譜峰的保留值和分離效果會發(fā)生改變。柱平衡一般需要5~10倍柱體積的初始流動相（如4.6×150mm的色譜柱為7~15ml）。然而，這一平衡體積也會隨流動相和樣品而異，需要試驗人員對平衡體積進(jìn)行試驗。
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更新時間：2011-04-14 
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